近年来，肿瘤免疫治疗在肿瘤学领域掀起了一场革命，并逐渐发展为一种有效且侵袭性低的治疗策略，可应用于各种恶性肿瘤的治疗[1]。在靶向肿瘤免疫疗法中，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T) 显示出优越的响应率，标志着癌症免疫疗法取得了巨大的成功[2]。
利用病毒载体是制备CAR-T细胞的主要方法。其中慢病毒载体(Lentiviral vectors，LVs) 因其高效的基因整合和在目标细胞基因中的稳定表达能力，成为基因治疗的理想工具[3]。LVs是通过对慢病毒自身的元件进行改造而发展起来的一类能够携带外源基因的病毒载体。其来源主要有：人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)、猿类免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus，SIV)、猫免疫缺陷病毒(Felines immunodeficiency virus，FIV) 等。其中HIV-1型载体系统研究得最为广泛和深入。LVs的整合模式相比其他病毒载体具有显著更低的致癌转化和随机转基因整合风险，因此使用LVs生产的CAR-T细胞产品具有很高的安全性和有效性。LVs还具有高效转导分裂细胞和非分裂细胞的优点，可以转导多种细胞，包括难以转导的细胞如造血前体细胞、神经元细胞、淋巴细胞和巨噬细胞[4]。此外，其生产成本相比其他病毒和非病毒基因治疗载体更低[5-6]。目前，基于慢病毒载体的基因治疗已得到临床试验的数据支持，例如利用基因修饰的CD34+细胞治疗严重遗传疾病和使用CAR-T细胞进行恶性血液病治疗，在临床试验中都得到了可靠的数据并且显现出良好的治疗效果[7]。
为获得高质量的LVs产品，保证其有效性及安全性，LVs产品的质量表征是关键。临床试验中的应用要求准确调整病毒载体剂量和细胞转导效率。然而由于病毒结构的复杂性，其检测也面临一些挑战。LVs中可能同时包含具有转导能力和转导缺陷的病毒颗粒或病毒裂解产物[7]。此外在载体制备过程中，宿主细胞不仅可以产生目标病毒颗粒，还可能产生包括外泌体和微囊泡在内的各种相关杂质[8]。这些细胞来源的杂质可能具有与LVs相近的关键理化性质，包括尺寸、净电荷和组成，使其难以分析，还可能会引起不必要的免疫反应。为了加快LVs产品的开发，迫切需要更加快速的检测技术，然而传统的病毒滴度等检测方法的检测时间长，难以满足此需求。这些因素使得LVs的准确、快速的定量检测成为难点。本文对现有LVs定量检测技术包括基于病毒功能性滴度及颗粒检测的方法进行了综述，对其优点和局限性进行讨论，并对未来的检测方法和存在的挑战作了进一步展望。
1 LVs定量检测方法的分类
LVs的滴定检测一般可分为生物功能法和物理法(或非生物功能法)[9]。生物功能法通过测定LVs在特定条件下转导特定细胞系的能力反映病毒的含量及生物活性。常用的两种生物功能法包括：1) 通过实时荧光定量PCR方法(RT-qPCR)测定靶细胞中前LVs的DNA拷贝数；2) 评估报告基因或转入基因在感染靶细胞中的表达水平。生物功能性滴度检测结果取决于检测方法、载体类型和检测条件[10]。物理法基于对载体颗粒组分含量或颗粒数量的评价确定病毒滴度(表 1)。例如测定P24衣壳蛋白浓度或基因组RNA拷贝数。物理法允许对病毒粒子进行实时定量，同时提供诸如粒径等信息。通常物理法难以区分感染性和非感染性载体，因此可能高估了功能载体的滴度，在预测LVs载体转导效率方面有局限性[11]。
慢病毒载体现有检测技术的比较
2 生物功能性滴度检测
2.1 流式细胞术(Fluorescence activated cell sorter，FACS) 测定病毒感染滴度
将LVs与靶细胞共培养，采用流式细胞术计算LVs感染目标细胞后其报告基因或转入基因在感染靶细胞中的表达水平，是测定LVs感染滴度的一种非常可靠的方法[22]。该方法通过将带有荧光标记的LVs样品进行逐级稀释，以保证达到合适的浓度，加入细胞悬液转导孵育后，使用光标记流式细胞仪测定荧光阳性细胞的百分比来计算LVs滴度。该方法仅可用于携带可靠标记基因的载体的效价测定，或在有针对LVs编码蛋白的特异性抗体可用时进行检测。在这些检测中常用的标记基因包括neo抗性基因、绿色荧光蛋白或其他活性染料[23]。所使用的标记基因应由在转导细胞中活跃的启动子控制(如HEK 293T)。该方法不仅用于最终LVs产品的测定，也常用于评价纯化过程，例如聂蓓娜等[23]在对不同浓缩方法对LVs回收效率的影响进行考察，发现超滤产生的滴度均高于1×1010 TU/mL，比超速离心法具有更高的收率。
FACS法能评价具有感染效力的病毒含量，但对报告蛋白的转基因表达的功能分析不能区分具有单个或多个整合事件的细胞，而且在组织特异性启动子的控制下测量转基因表达可能不可靠[5, 14]。此外，整个测定周期一般需要4 d，较为耗时。需要注意的是，研究表明FACS法测定LVs滴度受许多因素的影响，如转导过程、靶细胞的类型和数量等。转导条件的改变甚至会导致同一批载体的效价差异超过50倍[16]。
2.2 实时荧光定量PCR方法(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）
RT-qPCR法操作简便，重复性好，灵敏度高，是一种测定LVs滴度的最直接的方法。通过RT-qPCR方法可以检测非报告基因载体的病毒滴度及其感染效率，且不受启动子功能的影响[5]。目前基于Taqman和SybrGreenⅠqPCR策略，RT-qPCR已经被用于定量测定LVs不同核酸类物质的滴度，包括病毒载体中的病毒RNA、“强停止”负链cDNA以及靶细胞感染后的前病毒DNA及mRNA[24]。
测定病毒感染靶细胞后细胞DNA中的重组载体整合拷贝数，获得的是有感染效力的病毒颗粒数，属于生物功能性滴度[24]。RT-qPCR法的引物可基于内源性基因，如常见的调控元件WPRE序列设计定量引物[17]。该基因在正常情况下不存在于动物细胞内，因此可以用作检测基因。载体的长末端重复序列区(Long terminal repeats，LTRs) 也是常用的引物设计序列[25]。测定靶细胞中DNA滴度时，同时选择人源性的单拷贝基因白蛋白(Albumin，Alb) 基因作为内参基因[17]，最终计算每个细胞整合的LVs基因拷贝数。通过提取病毒RNA，经逆转录后进行RT-qPCR测定，计算得到的病毒颗粒数为所有收集到的病毒颗粒总数，既包括有感染效力的病毒，也包括无感染效力的病毒，属于物理法[25]。基于病毒RNA的RT-qPCR测定由于同时计算了缺陷或其他非感染性颗粒以及上清液中自由漂浮的载体基因组，因此可能大大高估了功能滴度。Gregory等发现靶细胞中的整合前病毒DNA滴度相比上清液中的病毒基因组RNA滴度大约低了200倍，但前者可能更接近LVs制剂的实际功能效价[18]。Scherr等通过比较载体上清病毒核酸滴度及靶细胞基因组中DNA滴度的结果，也发现具有感染活性的LVs约占0.1%-1.0%[26]。RT-qPCR测定LVs DNA整合事件的准确性也相比FACS法的传统方法要高[27]。对比实验发现基于报告基因表达的FACS法可能低估了功能病毒滴度，相比整合转基因的RT-qPCR反应滴度结果低了10-60倍[16]。FACS法结果偏低可能是因为部分报告基因整合后未表达，或者表达水平低的细胞未被FACS检测到。启动子较弱也可能导致报告基因降低表达，导致DNA和报告基因效价的差异。
RT-qPCR的定量需要采用参照基因的质粒DNA作为标准品，稀释不同浓度后分别作为模板进行PCR，并根据标准品的Ct值和拷贝数来绘制标准曲线，然后将LVs样品所测得的Ct值代入标准曲线获得相应拷贝数，计算LVs滴度[12, 28]。该定量结果在很大程度上取决于标准物质的质量[5]。随着新型液滴数字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR) 技术的出现，核酸的定量可不需要参照基因的标准曲线，进一步简化了样品制备，提高了检测量。ddPCR检测主要采用微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中分别进行PCR，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号(图 1A)。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸含量。Wang等[29]采用ddPCR对LVs滴度进行了检测，并与传统的FACS和RT-qPCR检测方法进行了比较。三种方法的结果具有较好的一致性，但ddPCR具有更高的灵敏度和精确度，相对标准偏差(Relative standard deviation，RSD) 值为11.1%，而FACS和RT-qPCR的RSD分别为18.7%和18.6% (图 1B)。
ddPCR定量检测LVs滴度
3 物理法检测
3.1 P24 ELISA
采用ELISA方法检测LVs衣壳蛋白P24的浓度水平也是针对不含报告基因的LVs常用的一种检测方法。采用双抗体夹心ELISA法测定抗原，即将抗P24单克隆抗体包被于微孔板中，将待测样品置于其中共孵育，样品中P24抗原则与抗体结合形成P24单抗-抗原复合物，加入酶标P24单抗再次孵育，酶标抗体与单抗-抗原复合物上的P24抗原结合，形成P24单抗-抗原-酶标抗体的夹心结构，最后与底物反应显色，终止反应后用酶标仪测定OD值。根据估计，每个LVs含有2 000个P24分子，1 ng的P24相当于1.25×107个LVs[30]。
由于P24滴度检测结果也包括了对非功能性的LVs的测定，因此该方法同样高估了感染性病毒的滴度。此外，它还检测了游离的、非LVs上的P24蛋白，这些蛋白在标准质粒共转染后释放到了上清液中，会进一步高估滴度结果。因此P24蛋白浓度与功能滴度之间往往只有粗略的相关性[16]。P24滴度的另一个缺点是有限的线性范围(13-200 pg/mL)，样品往往需要大量稀释，影响检测再现性[22]。虽然P24滴度不能反映病毒感染活性，但也具有一定的参考意义。根据文献报道，FACS法测定的感染性滴度与P24含量计算的LVs颗粒数的比值通常在1/100-1/1 000[24]。Geraerts等[22]对比了RT-qPCR检测RNA滴度、FACS法和P24 ELISA法3种方法的结果，3种方法的梯度稀释结果均具有较好的线性响应，R2分别为0.99、0.93和0.94。此外，FACS法结果与其他两种方法的比值和均能体现出不同LVs载体设计上的差异，具有一定相关性，但RT-qPCR和P24-ELISA二者之间的结果并没有一一对应的关系[22]。为了减少游离P24对LVs滴度检测的影响，一些ELISA试剂盒(QuickTiterTM Lentivirus Titer ELISA Kit，Cell Biolabs) 加入专用试剂将LVs从游离P24中分离出来(图 2)，定量测定只与LVs相关的P24水平[19]。
QuickTiterTM Lentivirus Titer ELISA Kit与传统试剂盒的对比图
3.2 纳米粒子跟踪分析(Nanoparticle tracking analysis，NTA)
NTA是一种较新的颗粒检测技术，可以快速获得尺寸分布与颗粒计数信息，适用于分析30-1 000 nm的颗粒，如病毒和病毒聚集物等[20]。NTA分析技术的原理是利用溶液中粒子的布朗运动产生的散射光，通过显微镜和电荷耦合器件(CCD) 照相机记录颗粒的布朗运动随时间的函数分布图，首先计算粒子扩散系数，然后通过斯托克-爱因斯坦方程分别和实验变量(如粒子数、样品体积等) 计算流体动力直径和粒子浓度。由于NTA方法同时测量单个粒子，具有检测速度快的优点，最快的检测时间可以在5 min内完成。此外，NTA可同时获得颗粒的尺寸和颗粒数量信息，在定量分析的同时，可分析所得样品的尺寸分布及聚集情况。Papanikolaou等[13]采用NTA分析了通过超滤制备LVs的效果，表明制备得到的LVs颗粒的平均直径为100 nm左右，为尺寸正常的颗粒，并且检测到了少量400-500 nm的聚集体(图 3)。
NTA检测的缺点同样是无法区分感染性与非感染性的病毒。Papanikolaou等将NTA的颗粒计数结果与FACS法进行比较，仅有约0.1%的病毒具有感染活性。尽管NTA无法反映感染滴度，但Kumru等[31]发现NTA颗粒计数的结果与RT-qPCR测定病毒基因组拷贝数的结果的相关性达到R2=0.80。作者进一步利用NTA检测速度快的优势，对大量稳定剂进行了筛选，并成功获得了能够减少在容器吸附和冻融过程中病毒颗粒损失的稳定剂。以上应用表明，NTA作为一种快速检测方法用于建立LVs的制备工艺具有一定优势。需要注意的是，为了保证检测结果的准确性，NTA检测过程中需要保持颗粒数在107-109颗粒/mL。此外，NTA对多分散样品，例如未经纯化的样品的表征准确性较差[15]。
慢病毒载体颗粒的NTA分析图
3.3 可调电阻式脉冲传感(Tunable resistive pulse sensing，TRPS)
对病毒类产品的质量控制不仅包括纯度和定量，最理想的情况下是实时获得更多的参数，比如尺寸分布、电荷性、浓度等。TRPS是一种实时的纳米颗粒分析技术[32]，能够在几种不同的纳米粒子包括二氧化硅纳米粒子、DNA包裹的纳米粒子、腺病毒和脂质体中测量纳米粒子的粒度和粒度分布，具有良好的准确性、精密度和灵敏度[33]。这项技术基于库尔特原理，采用非导电膜上的一个孔将两个电解质流体室与一个电极隔开，两个电极建立稳定的基线电流(图 4A，Current)。将样品加载到其中一个流体室中，当样品中的颗粒通过孔隙时，基线电流发生形变，即产生“阻塞事件” (图 4B，Blockades)。通过监测阻塞事件数、震级和阻塞宽度等(图 4C)，可以原位阐明样品颗粒的zeta电位、尺寸大小和浓度[34]。TRPS通过机械拉伸调节空隙的性质，使颗粒的测量范围可从40 nm到200 μm，适合LVs等病毒的分析[34]。
TRPS装置及原理示意图[
Ikeda等使用TRPS量化了来自稳定慢病毒细胞系STAR-A-HV的慢病毒载体颗粒[15]。结果表明，TRPS所测得的颗粒浓度(7.99×1010颗粒/mL) 明显高于FACS滴度(1.08×106颗粒/mL)，但低于RT-qPCR法(2.33×1012颗粒/mL)。这表明只有0.001%的病毒粒子具有传染性。这一结果与报道的NTA及P24等其他检测方法测定结果相比，具有感染活性的病毒所占比率降低了100倍[13, 24]。由于FACS滴度检测受病毒载体及检测参数的影响，因此不同实验室及检测技术的检测结果实际上难以互相比较。但基于颗粒分析的技术确实有可能过高地估计了病毒载体数量，因为样品中可能还存在细胞碎片等干扰物。经过一定的分离方法去除干扰性的杂质后，获得的结果会更加准确。Heiderdeng等[34]提出了一个结合尺寸排阻色谱(Size exclusion chromatograph，SEC) 和TRPS的集成平台，分析LVs粒子的收率和纯度，并通过颗粒大小和表面电荷迁移率表征LVs制剂，用于监测LVs的生产和纯化。根据TRPS的结果不仅检测到了SEC不同收集组分中的颗粒浓度(图 5A)，还对所收集颗粒的尺寸分布进行了分析(图 5B)，得到的平均尺寸与NTA的结果具有一致性[34]。通过比较不同种类LVs产品的电荷迁移率，可以反映LVs的表面化学性质的改变(图 5C)，因此TRPS可以进一步发展为鉴定不同病毒类型或状态的工具。
TRPS浓度、大小、电荷分布图
3.4 病毒计数仪(Virus counter，VC)
目前，美国ViroCyt公司已经开发出一种类似流式细胞仪的设备病毒计数仪(Virus counter，VC)，适用于液体样本中的包括慢病毒等多种病毒的定量。VC使用两种不同的荧光染料对病毒样本进行染色：一种与蛋白质结合，另一种用与核酸结合。染色后的病毒通过活动室时被激光激发后，被标记的蛋白与核酸分别产生相应荧光信号。只有同时具有蛋白与核酸信号的颗粒才会被计算为病毒颗粒。该检测技术具有分析速度快、样品制备简单的优点。VC使用的病毒染料为非特异性，相比于FACS需要特异性的荧光抗体，成本更低。经过30 min左右的染色，VC可在10 min之内，最短5 min完成对带有荧光染料的病毒颗粒分析。为了保证足够的检测信号和可靠的结果，VC检测要求病毒尺寸大于25 nm，并需要病毒基因组有一定的长度(> 9 000 nt/bp)，因此LVs能满足检测要求。其可靠的测量范围是5×105-1×109颗粒/mL[15]。Gates等[21]采用与表达水泡性口炎病毒的G-糖蛋白(G-glycoprotein of vesicular stomatitis virus，VSV-G) 表位的完整慢病毒载体颗粒具有高亲和力的血清特异性荧光标记抗体，通过VC实现了LVs的快速定量。
4 总结与展望
综上所述，目前已有多种生物功能性及非生物功能性滴度的检测方法用于LVs的定量及质量控制。带有报告基因的LVs的功能性滴度可以使用FACS法进行滴定。对于缺乏基因标记物的LVs，或携带在293 T细胞中可能不起作用的启动子的LVs，则可通过RT-qPCR定量测定基因组DNA中的病毒基因的滴度。对LVs的非功能性滴度检测方法众多，尤其是随着纳米颗粒检测新技术如NTA、TRPS的应用，可实现对病毒单个颗粒的计数。在基因治疗中，感染性LVs的比例会极大地影响基因转导的效率，因此是LVs产品质量控制的重要参数。通过比较功能性滴度与非功能性滴度的比例，可以反映感染性颗粒的比例，对开发LVs制备工艺及制剂质量都具有很好的指导作用。根据文献中的结果，感染性病毒在总颗粒中往往只占极小的一部分。导致非感染性病毒颗粒产生的原因包括：1) 病毒形成时产生无感染性的颗粒如病毒空壳、未成功组装的亚基蛋白等；2) 制备过程中外界因素如纯化过程中的环境压力、溶液条件等造成病毒活性降低或失活[15]。此外一个尚未研究清楚的问题是细胞产生的其他脂类囊泡如外泌体对LVs颗粒计数的干扰。外泌体是病毒培养时常见的“污染物”，并不会影响病毒感染滴度的测定，但具有与LVs相近的尺寸甚至组成。这些因素可能也是导致不同LVs产品检测结果差异较大的原因之一。
理想的LVs质量控制方法应该具有准确性、重复性、尽量快的检测速度，并能提供尽可能多的质量信息。尽管FACS、RT-qPCR及P24 ELISA法应用最广，但很多研究结果发现，这些方法之间往往一致性较差，且容易受LVs自身性质及操作条件的影响，导致不同实验室之间的结果也存在差异[35]。目前还没有一个被广泛接受的适用于所有应用的标准方法，针对一种慢病毒载体的滴度检测大多通过同时采用几种方法分析对比，来增强结果的准确性[5]。尽管目前在LVs中应用尚不多，但NTA或TRPS等方法在病毒分析上的应用已经越来越广泛。这些颗粒分析技术能够对LVs在定量的同时分析病毒的尺寸、电荷，反映病毒聚集等，为我们提供更多的质量信息，且具有检测速度快的优点。事实上，有更多的分析技术已经应用在了病毒的检测。例如尺寸排阻色谱和场流分级(Field-flow fraction，FFF)，与多角度光散射(Multi-angle laser light scattering，MALLS) 检测器偶联后可以实现对不同尺寸颗粒的分离，并同时进行颗粒浓度测定及分子量、尺寸的测定，已经应用于流感病毒及多种病毒样颗粒的检测[36]，可以分析不同的病毒亚型。同样，在针对纳米颗粒的研究中，毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE) 也是一项重要的表征技术，Mironov等[37]建立了病毒定量CE (Viral quantitative capillary electrophoresis，VqCE) 来定量病毒颗粒。VqCE与qPCR类似，然而VqCE的优势是能够区分完整的病毒组分和游离的DNA。将这些分离技术与颗粒检测技术结合，可以更好地区分LVs产品中不同的粒子，提供更详细、准确的质量信息。
参考文献
陈思琪, 张松平, 杨延丽, 等. 慢病毒载体定量检测方法的研究进展. 生物工程学报, 2021, 37(7): 2283-2292